本发明提供了一种检测类志贺邻单胞菌的方法,所述方法利用环介导等温扩增技术,以hugA基因为目标基因,通过设计3对DNA引物,与待检测的DNA模板放入包括MgSO
1.一种用于非诊断目的的检测类志贺邻单胞菌的方法,所述方法包括如下步骤:xa0(1)将DNA提取物、序列如SEQxa0IDxa0NO1-2所示的一对外引物、序列如SEQxa0IDxa0NO3-4所示的一对内引物、序列如SEQxa0IDNO5-6所示的一对环引物、dNTP、Bstxa0DNA聚合酶、MgSO₄、甜菜碱以及Bstxa0DNA聚合酶缓冲液加入到反应容器中;其中,所述MgSO₄的浓度为6mM,所述甜菜碱的浓度为10mM;xa0(2)将步骤(1)所得的混合液放置于65°C恒温环境中进行DNA扩增反应;xa0(3))将步骤(2)获得的产物放置于80°C恒温环境中,以终止步骤(2)所述的DNA扩增反应;xa0(4)检测步骤(3)获得的产物。xa0
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述的DNA扩增反应时间为1小时。xa0
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中所述的终止反应时间为5分钟。xa0
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)所述的检测方法可以是电泳检测法、浊度检测法、或染色检测法。xa0
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述染色检测使用的染料为SYBRxa0greenxa0Ixa0荧光染料。xa0
6.一种检测类志贺邻单胞菌的试剂盒,所述试剂盒包括:序列如SEQxa0IDxa0NO1-2所示的一对外引物、序列如SEQxa0IDxa0NO3-4所示的一对内引物、序列如SEQxa0IDxa0NO5-6所示的一对环引物、dNTP、Bstxa0DNAxa0聚合酶、MgSO₄、甜菜碱、Bstxa0DNA聚合酶缓冲液。xa0
7.根据权利要求6所述的试剂盒其特征在于所述试剂盒还包括DNA提取试剂盒。xa0技术领域
本发明涉及一种类志贺邻单胞菌的快速诊断方法,属于微生物快速诊断领域。
背景技术
类志贺邻单胞菌(Plesiomonasxa0shigelloides)是一种革兰氏阴性、能运动、兼性厌氧、氧化酶阳性的非孢子繁殖的细菌,曾与对人类致病的弧菌属和气单胞菌属一起归属于弧菌科,后研究发现其在分子水平跟类志贺邻单胞菌和变形杆菌属更为接近,在第二版《系统细菌学伯杰氏手册》中,类志贺邻单胞菌划归到肠杆菌科,邻单胞菌属。淡水水源和江河水生态环境是类志贺邻单胞菌的主要储存地,鱼类是类志贺邻单胞菌常见的宿主。最近几年由该菌引起的婴幼儿、老年人以及免疫功能不全病人的胃肠道感染病例逐渐增加,是人类肠胃炎的主要病因之一,世界各地屡有报道。类志贺邻单胞菌亦可引起人类菌血症、蜂窝组织炎、脑膜炎等肠外感染,该菌亦与旅行者腹泻密切相关。来自日本的一项研究发现在1994至1996年间所有引起旅行者腹泻的肠杆菌中,类志贺邻单胞菌位居第一(66.7%)。由类志贺邻单胞菌引起的死亡率也在逐渐增高。一些类志贺邻单胞菌的感染者由于未能快速准确的诊断和合理的应用抗生素,而没有得到及时的治疗而产生了严重的后果,甚至死亡。虽然类志贺邻单胞菌诱发肠胃炎的致病机理并未完全阐明,但研究者已经对一些潜在的毒力因子进行了深入的研究。摄取铁离子与一些病原菌的毒力密切相关,人体中的亚铁血红素是病原菌铁离子的一个重要来源,并且许多病原菌本身就具有亚铁血红素运输系统,hugA基因是编码类志贺邻单胞菌亚铁血红素铁离子利用系统的重要基因之一,并且编码外膜蛋白受体,是影响类志贺邻单胞菌毒力的一个重要基因,因此也是一个理想的检测目的基因。目前类志贺邻单胞菌的检测方法主要有分离培养、生化鉴定,普通PCR和实时荧光PCR等分子生物学方法。分离培养方法操作步骤繁琐,检测周期长,一般需要3-5天完成,不能满足快速检测的需求。并且该菌缺少特异的筛选培养基,在一些肠道培养基上形成的菌落性状与嗜水气单胞相似,难以区别,这也影响了类志贺邻单胞菌的分离率。最近几年,PCR和实时荧光PCR分子生物学检测方法在病原菌检测中的应用越来越广,但这些方法的检测成本高,需要精密昂贵的热循环仪器,且对实验环境和操作者的技术也有严格的要求,因此限制了该技术的普遍适用性,不利于在农村地区以及基层实验室的推广应用。类志贺邻单胞菌做为一种新发的传染性疾病对流行病学家和临床医生造成的最大困难就是缺少能够对其进行早期、快速、准确检测的方法,以满足农村地区和基层实验室的实际工作需求。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedxa0isothermalxa0amplification,LAMP)是Notomi等建立的一种新的核酸扩增方法。LAMP是针对靶序列的6个特异部位设计4条引物,利用具有链置换活性的Bstxa0DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成,从而使靶序列高效扩增。4条引物之中2条为内引物,即FIP(ForWardxa0innerxa0primer,FIP)和BIP(Backwardxa0innerxa0primer,BIP)。FTP包含Flc和F2(F2c区域的互补序列),即5′-Flc-F2;BIP包含B1c(B1区域的互补序列)和B2,即5′-Blc-B2。外引物为F3和B3。LAMP反应过程包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段。LAMP反应中60~65°C是双链DNA复性及延伸的中间温度,DNA在65°C左右处于动态平衡状态,任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时,另一条链就会解离,变成单链。在链置换型DNA聚合酶的作用下,以FIP引物F2区段的3′末端为起点,与模板DNA互补序列配对,启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前端F3c序列互补,以3′末端为起点,通过链置换活性DNA聚合酶的作用,一边置换先头FIP引物合成的DNA链。一边合成自身DNA,如此向前延伸。最终F3引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链,这条单链在5′末端存在互补的F1c和F1区段,于是发生自我碱基配对,形成茎环结构。同时,BIP引物同该单链杂交结合,以BIP引物的3′端为起点,合成互补链,在此过程中茎环结构被打开。接着,类似于F3,B3引物从BIP引物外侧插入,进行碱基配对,以3′端为起点,在聚合酶的作用下,合成新的互补链。通过上述2个过程,形成双链DNA。被置换的单链DNA两端存在互补序列,自然发生自我碱基配对,形成环状结构,于是整条链呈现哑铃状结构,该结构是LAMP法基因扩增循环的起始结构。LAMP法基因扩增循环阶段:首先在哑铃状结构中,以3′末端的F1区段为起点,以自身为模板,进行DNA合成延伸。与此同时,FIP引物F2与环上单链F2c杂交,启动新一轮链置换反应,解离由F1区段合成的双链核酸。同样,在解离出的单链核酸上也会形成茎环结构。在茎环结构上存在单链形式B2c,BIP引物上的B2与其杂交,启动新一轮扩增,经过相同的过程,又形成茎环结构。通过此过程,结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。为了进一步缩短LAMP的反应时间,还可以在F1c-F2c/B1c-B2c之间设计一对环引物LF/LB,环引物通过结合在茎环结构的环状区域互补序列上,大大加速了整个链置换反应过程,从而提高了反应效率。LAMP可以特异、高效、快速的扩增DNA,在1小时之内使产物的量达到10⁹个拷贝。LAMP方法最大的缺点就是容易出现假阳性,由于LAMP采用了多条引物,而且是在同一温度条件下进行扩增,引物之间有可能互补而扩增出非特异性条带,造成假阳性。因此LAMP方法对引物的特异性要求很高,设计也更为复杂。由于LAMP省略了94°C变性步骤,同时退火和延伸步骤在同一温度(等温)条件下进行,反应体系的组成也较传统PCR复杂,除了反应体系中必须的缓冲液、dNTP引物、酶等成分外,还需要加入甜菜碱(betaine)、硫酸镁等必需成分,反应体系较为复杂,对体系中主要成分的配比优化液要求较高,否则会降低反应的特异性和灵敏性。本发明的目的就是通过引物设计和组分优化,建立一种类志贺邻单胞菌的方便、快速、特异、灵敏的LAMP检测方法,以能够在基层实验室进行大规模的推广使用。
发明内容
本发明提供了一种检测类志贺邻单胞菌的方法,所述方法包括如下步骤:(1)将待检测样本、序列如SEQxa0IDxa0NOxa01-2所示的一对外引物、序列如SEQxa0IDxa0NOxa03-4所示的一对内引物、序列如SEQxa0IDxa0NOxa05-6所示的一对环引物、dNTP、Bstxa0DNA聚合酶、MgSO₄、甜菜碱以及环介导等温扩增缓冲液加入到反应容器中;(2)将步骤(1)所得的混合液放置于65°C恒温环境中进行DNA扩增反应;(3))将步骤(2)获得的产物放置于80°C恒温环境中,以终止步骤(2)所述的DNA扩增反应;(4)检测步骤(3)获得的产物。其中,SEQxa0IDxa0NOxa01为引物F3,SEQxa0IDxa0NOxa02为引物B3,SEQxa0IDxa0NO3为引物FIP,SEQxa0IDxa0NOxa04为引物BIP,SEQxa0IDxa0NOxa05为引物LF,SEQxa0IDNOxa06为引物LB。本方法检测的目的基因为类志贺邻单胞菌的hugA基因,引物设计所依据的基因序列为(Genexa0Bankxa0ID号:AY008342.1),SEQxa0IDxa0NOxa01-6在hugA基因序列中的位置如表1所示。表1实验中所用到的LAMP引物序列ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>在一个优选的技术方案中,步骤(1)中所述MgSO₄的浓度为6mM,所述甜菜碱的浓度为10mM。步骤(1)中所述待检测样本可以是临床送检标本,优选为DNA提取物。在本发明的一个优选技术方案中,步骤(2)中所述的DNA扩增反应时间为1小时。在本发明的一个优选技术方案中,步骤(3)中所述的终止反应时间为5分钟。在本发明的又一个优选技术方案中,步骤(4)所述的检测方法可以是电泳检测法、浊度检测法、或染色检测法。电泳检测法:由于扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物,电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱,可以根据片段大小进行判定。浊度检测法:LAMP在合成DNA的同时还产生大量的焦磷酸根离子,它们能与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀,可根据反应体系中是否形成白色沉淀来定性判断LAMP反应是否发生,以及根据浊度值对结果进行定量分析。染色检测法:可以向扩增产物中加入能掺入到双链DNA中的荧光染料,例如SYBYxa0Greenxa0I,有阳性扩增者电泳结果显示为绿色,无阳性扩增者,则不显色。本发明还提供了一种检测类志贺邻单胞菌的试剂盒,所述试剂盒包括:序列如SEQxa0IDxa0NOxa01-2所示的一对外引物、序列如SEQxa0IDxa0NOxa03-4所示的一对内引物、序列如SEQxa0IDxa0NOxa05-6所示的一对环引物、dNTP、Bstxa0DNA聚合酶、MgSO₄、甜菜碱、环介导等温扩增缓冲液。在一个优选技术方案中,所述MgSO₄的浓度为6mM,所述甜菜碱的浓度为10mM。优选地,所述试剂盒还可以包括DNA提取试剂盒。发明人建立了使用了LAMP技术对类志贺邻单胞菌进行检测的方法。在LAMP反应体系的建立过程中对MgSO₄,反应添加剂甜菜碱的浓度进行了筛选,通过对反应时间、反应灵敏度以及产物生成量等方面进行比较,最终确定了MgSO₄,甜菜碱的最佳浓度,从而建立了类志贺邻单胞菌的LAMP检测试剂盒。通过对LAMP检测和实时荧光PCR的检测进行比较,我们发现LAMP检测无论在检测灵敏度上还是在检测速度上都明显的优于实时荧光PCR。一般情况下,以分子水平为基础的检测方法例如PCR和LAMP都会受临床标本中抑制物的影响,一些研究者报导LAMP使用的Bst聚合酶对样品中抑制物的耐受能力比实时荧光PCR中的Taq酶要强,并且比实时荧光PCR的反应速度至少快20分钟以上,可以显著缩短总体检测时间。相比之下,LAMP检测技术具有很多的优势:(1)LAMP对靶序列扩增效率高,体系中其他共存非靶DNA对其扩增的影响较小。LAMP的检测下限为几个拷贝,灵敏度远远高于普通PCR技术,有研究者证实LAMP的灵敏度等于甚至高于实时荧光PCR的检测灵敏度。(2)产物检测方便、快捷。因为LAMP在合成各种茎环DNA的同时还产生大量的副产物-焦磷酸盐,并且生成白色的焦磷酸镁沉淀物。Mori等利用这些特性来检测LAMP产物,可以直接根据沉淀的形成来定性判断扩增反应是否发生,还可以通过检测其产物浊度的变化进行实时定量检测。(3)LAMP对靶序列扩增的特异性高。由于LAMP通过2对引物(F3、B3、FIP和BIP)与靶序列上相应的6个特异部位准确结合来产生扩增效应,因此可以获得比PCR更高的特异性,并且可以部分减少一般核酸扩增技术中不可避免的背景干扰。(4)设备简单,易操作。LAMP反应只需要一个普通的水浴锅或者恒温装置,不需要昂贵的PCR仪,易于在基层实验室和农村地区推广应用。(5)反应速度快。LAMP是恒温扩增反应,没有PCR反应中温度变化大的耗时,一般在30min~60min内即可完成,比普通PCR和实时荧光PCR反应速度更快,能更好地满足临床快速检测的要求。另外,在LAMP反应体系中增加2条环引物(LF和LB)可使反应所需时间比原来缩短一半,整个反应可以在30min内完成,大大提高了检测效率。这些特性使得LAMP技术更适用于在基层实验室、地方疾控、广大农村地区以及现场处理疫情时使用。总之,本发明建立的LAMP方法是首次将LAMP技术运用到了类志贺邻单胞菌的检测,该方法在1小时内就可以观察结果,满足了临床快速诊断的需要,并且该方法对临床样本的灵敏度高于实时荧光PCR法,反应时间更快,所需仪器设备简单,可作为一种快速的筛查方法在临床检验检疫、基层实验室及农村地区进行大规模的推广使用
附图说明
图1:LAMP反应的浊度值检测结果图;图2:LAMP反应电泳检测结果图;图3:LAMP反应的染色检测结果图;图4:4份类志贺邻单胞菌标本的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明权利要求所定义的保护范围构成任何限制。本发明实施例所用标准菌株购自中国药品生物制品检定所,其他菌株分离自食品、粪便和呕吐物等样品,均经德灵WALKAWAY-40SI全自动微生物分析仪鉴定。用于特异性评价的菌株见表1。实施例1:4份类志贺邻单胞菌的检测通过对GenBank中已知的类志贺邻单胞菌hugA基因序列(GeneBankxa0ID号)进行比对,我们选择hugA基因上的一段保守序列作为检测靶标。使用引物设计软件PrimerExplorerxa0V4xa0software(http://primerexplorer.jp)(Eikenxa0Chemicalxa0Co.Ltd.,Tokyo,Japan)在线进行LAMP引物设计。引物由上海生工有限公司合成(见表2)。LAMP的反应体系如下:引物SEQxa0IDxa0NOxa01和SEQxa0IDxa0NOxa02的浓度为5pmol,引物SEQxa0IDxa0NOxa03和SEQxa0IDxa0NO4的浓度为40pmol,引物SEQxa0IDxa0NOxa05和SEQxa0IDxa0NOxa06的浓度为20pmol,10mM的Betain,6mM的MgSO₄,1mM的dNTP,2.5μL的10×Bstxa0DNA聚合酶缓冲液,8U的链置换DNA聚合酶,2μL的模板,补加去离子水至25μl。整个反应在LA320实时浊度仪(Teramecs,Tokyo,Japan)中进行,等温扩增65°C1h,80°C5min终止反应。结果可以根据沉淀的形成来定性判断,也可以通过检测产物浊度的变化进行实时定量检测。图4为4份类志贺邻单胞菌的检测结果。图4中,4份类志贺邻单胞菌和一份大肠杆菌的标本采用本研究建立的LAMP检测体系进行检测,结果4份类志贺邻单胞菌标本均在60分钟以内出现了阳性扩增曲线,而大肠杆菌标本则无扩增曲线出现,说明本研究建立的LAMP检测体系可以对类志贺邻单胞菌进行快速、有效的检测。实施例2:LAMP检测的灵敏度评价:1.含hugA基因的质粒标准品的构建与制备(1)使用hugA特异引物进行PCR扩增后得到目的片段;(2)切胶回收,纯化PCR产物;(3)连接到T载体;(4)转化JM109感受态细胞;(5)筛选阳性克隆子,用PCR进行验证,最终测序确认;(6)提取质粒,根据质粒的分子量将质粒样品浓度换算为拷贝数浓度:每μL样品中检测基因的拷贝数=浓度(ng/μL)×阿佛加德罗常数×10^-9/(660×重组质粒碱基数);(7)用Easyxa0Dilution将上述质粒依次稀释成1.0×10⁰拷贝/μL~1.0×10⁶拷贝/μL,共7个浓度梯度。2.LAMP检测体系的灵敏度取质粒标准品每反应体系10⁰拷贝至10⁶拷贝为模板,每个浓度进行3次重复,以实时荧光PCR为对照,评价LAMP检测体系的灵敏度。评价结果:LAMP和实时荧光PCR针对hugA基因的检测下限分别为20拷贝/反应(图1)和200拷贝/反应(copies/reaction)。这个结果说明LAMP在检测类志贺邻单胞菌DNA时比实时荧光PCR更灵敏。图1为将类志贺邻单胞菌质粒标准品进行10倍系列稀释后,用LAMP检测体系进行扩增,评价该体系的灵敏度。图中扩增曲线的浓度分别为2.0×10⁶~2.0×10¹拷贝/反应。可以用电泳的方法来检测LMAP的扩增结果(图2),也可以加入1μL的1,000×SYBRxa0greenxa0I(图3)通过肉眼观察颜色的改变来检测。图1为hugA-LAMP的灵敏度通过浊度仪实时监测的结果。检测下限为每个反应20拷贝。图2为用琼脂糖凝胶电泳分析hugA-LAMP的扩增产物。泳道M:DL2000marker;泳道1:2×10⁶拷贝/反应;泳道2:2×10⁵拷贝/反应;泳道3:2×10⁴拷贝/反应;泳道4:2×10³拷贝/反应;泳道5:2×10²拷贝/反应;泳道6:2×10¹拷贝/反应;泳道7:2×10⁰拷贝/反应;泳道8:无模板。图3为用SYBRxa0greenxa0I荧光染料检测hugA-LAMP扩增产物.当存在阳性扩增时,SYBRxa0Greenxa0I染料的桔色快速变为绿色,在黑色背景下更为显著;当扩增为阴性时,管内颜色维持桔色不变。实施例3:LAMP检测的特异性评价:以常见致病菌及条件致病菌DNA(见表2)为模板评价LAMP体系的特异性。LAMP检测的特异性使用52株常见致病菌及条件致病菌DNA(见表2)进行评价。20株类志贺邻单胞菌均在1小时内出现了阳性扩增,32株非类志贺邻单胞菌都未出现扩增,说明该LAMP检测技术的特异性好。表1实验中所用到的菌株ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>实施例4:LAMP检测的重复性评价:进行批内实验时,在一次实验中将3份不同浓度的质粒标准品(10⁶,10⁴,10²)做10次重复测定,将所得检测结果进行分析,求出CVi;进行批内实验时,将3份不同浓度的质粒标准品(10⁶,10⁴,10²)做10个重复测定,10天时间内分10次进行,将所得检测结果进行分析,求出CVo。LAMP检测重复性通过3份不同浓度的质粒标准品(10⁶,10⁴,10²)来评价。批内变异系数为1.21%-1.54%,批间变异系数为2.17%-3.23%。数据显示,本发明的LAMP具有良好的重复性。实施例5:评价LAMP技术在粪便模拟样本中的应用(1)类志贺邻单胞菌(ATCC51903)摇菌至对数生长期;(2)用磷酸盐缓冲液将该菌进行连续10倍稀释,并进行平板计数;(3)取健康人新鲜粪便0.2g/管,分别加入100μl不同浓度的类志贺邻单胞菌稀释悬液,制成5×10¹~5×10⁷CFU/g梯度浓度的粪便模拟标本;(4)应用QIAampxa0DNAxa0stoolxa0minixa0kit(QIAGEN,Venlo,Netherlands)试剂盒抽提所有粪便标本,每个菌量浓度进行3次重复,平行独立提取DNA进行LAMP检测。结果:LAMP检测在粪便模拟标本中的检测下限为5×10³CFU/g,相比之下,实时荧光PCR针对hugA基因在粪便模拟标本中的检测下限为5×10⁴CFU/g,说明LAMP比实时荧光PCR对粪便模拟标本的检测更灵敏。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="397"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="441"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>